本发明涉及一种蛹虫草培养基及其制备方法和应用，所述蛹虫草培养基由A液与B粉混合制成；其中，所述A液含有如下浓度的成分：KH₂PO₄1.2~1.5g/L；NaH₂PO₄ 0.8~1.2g/L；所述B粉含有以重量计的干蚕蛹粉和大米粉，且A液与B粉的液固比为1:1；以纯净水将KH₂PO₄、NaH₂PO₄溶解、并充分混匀后再加入干蚕蛹粉、大米粉混合均匀，装入培养瓶，密封，灭菌，冷却。本发明所提供的蛹虫草培养基可用于培养蛹虫草。本发明通过研究大米和干蚕蛹粉的最佳比例而首次找到可培养出含有较高虫草素含量的蛹虫草的培养基，并发现其中干蚕蛹粉所占比例为40%以上时，虫草素的含量有所增加，并且在50%、80%以及100%时虫草素含量较佳。