本发明涉及的鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域。鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，该试剂盒由一扩反应混合液、二扩反应混合液、阴性对照和阳性对照组成。本发明将采用套式PCR扩增，且目的片段较小，保证了反应的高灵敏度。检测总时间控制在4小时左右，达到了快速检测的目的。本发明能彻底解决伪狂犬流行毒株和gE基因缺失疫苗毒株鉴别诊断问题，快速、灵敏，特异性好，非常适合伪狂犬疫情的大面积快速检测普查，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场。