本发明公开一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，该方法是将破壁灵芝孢子粉提取得到灵芝孢子油，在加入石油醚，乙醇等有机溶剂和纯净水进行提取，提取得到的下层溶液进行浓缩，浓缩液使用大孔树脂柱等进行柱分离，用纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；收集最后一次洗脱液经冷冻干燥后得到抗肿瘤组合物。通过本发明得到的组合物能抑制体外及体内的肿瘤细胞生长，抑瘤率达到56.3%以上。