本发明涉及一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用，从蚕丝中提取丝素蛋白，制成重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液；将聚乙二醇或丙二醇用纯净水配制成重量百分比为50～100％的聚乙二醇或丙二醇溶液，然后将所述聚乙二醇或丙二醇溶液置于室温下保存；再将所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液与所述聚乙二醇或丙二醇溶液进行充分混合，得到共混液，所述共混液经过1～10分钟凝固形成所述可注射丝素蛋白原位凝胶；其中，所述聚乙二醇或丙二醇溶液与所述重量百分比为3～30％的丝素蛋白水溶液的体积比为2：1～1：2。本发明方法操作简单，可长期保存。