本发明公开了一种三维空心光斑生成方法和装置。该装置包括激光器、单模光纤和准直透镜、第一偏振分光棱镜、若干光线折转组件、两相位调制器、第二偏振分光棱镜、1/4波片、显微物镜、样品面和介质膜反射镜。该方法包括：分别对垂直线偏振光和平行线偏振光进行不同的相位调制，将调制后两光束合束后经同一1/4波片转换为两圆偏振光，再经显微物镜投射后透过样品面并被介质膜反射镜反射，入射到样品面的反射光线和投射光线发生干涉，分别形成横向和轴向空心光斑，两者光强叠加形成三维空心光斑，其横向尺寸可为0.56个波长，轴向尺寸可为0.44个波长。本发明可应用于受激发射损耗显微镜等超分辨显微设备中实现三维超分辨显微。