本发明公开了一种奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，包括由四对特异性引物构成的引物对组。应用本发明结合多重PCR技术可一次性同时扩增致病性无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的特异性基因sip、nuc、rrnB和HblA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，能对奶样中存在的主要病原菌进行全面、高效、准确的检测与鉴定。本发明克服了常规病原菌检测技术操作繁琐、费时耗力等缺点，增加病原菌检查的种类，提高了检测的特异性和灵敏度，具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，适合在基层兽医站和奶牛养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。