本发明涉及一种在静置条件下制备微米级聚合物单分散微球的方法，该方法是在室温下将二异氰酸酯单体与水-丙酮混合溶剂加入到反应瓶中，其中水/丙酮的质量比为20/80～60/40，二异氰酸酯类化合物占聚合体系总质量的0.5～13.0%，密封摇匀后将反应瓶静置于20～80℃的恒温水浴中进行聚合反应；聚合完成后产物经过离心分离及干燥即得微米级单分散聚脲微球。本发明仅使用一种单体，无需任何搅拌或者振荡、完全在静置条件下进行沉淀聚合，反应耗时短、单体可完全转化，微球收率高，操作简单，有利于单分散微球的规模化生产。所得微球表面洁净且含有大量胺基，可用于蛋白质的吸附与分离、酶固定和色谱分析等领域。