本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。实验证明，应用本发明仅需一次RT-PCR反应就能同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和新城疫病毒两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为DNA和/或RNA，最低能同时检出10pg鸭坦布苏病毒RNA、10pg新城疫病毒RNA，这为两种病毒的发病早期提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。