本发明公开了一种编码悬浮微芯片、其制备方法及应用。该微芯片包括：透明基底，以及，用作图形识别码的不透明平面微结构，所述不透明平面微结构分布在透明基底表面。优选的，所述不透明平面微结构包括形成于透明基底表面的高反光堆叠结构层。该微芯片可经半导体微加工工艺制得，其应用模式为：首先利用悬浮在液相体系中的微芯片上的探针分子捕获待测物分子，再将微芯片从液相体系中分离、清洗，之后分别在可见光通道和荧光通道对微芯片成像，以分别确定微芯片所捕获的目标分子身份和对目标分子进行定量分析。本发明实现了具有高通量、良好检测精度的编码悬浮微芯片的低成本制造，可应用于对液体样品中的多重生物/医学指标同时进行检测。