本发明公开了一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.1、2所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen？Ⅰ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成)。本发明的方法，既可用于养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。