本发明公开了尼罗罗非鱼Y染色体特异分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，可通用于多种品系的尼罗罗非鱼；基于该分子标记构建了尼罗罗非鱼遗传性别鉴定方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼XY♀、转化雌鱼YY♀与超雄鱼YY♂，基于上述遗传性别鉴定方法可以通过YY超雄鱼与正常雌鱼XX♀交配实现全雄鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；此外，利用Y染色体特异分子标记还建立了超雄鱼YY♂与转化雌鱼YY♀交配生产YY超雄鱼的方法。