本发明公开了提供一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方法。所述小鼠核糖体基因区打靶载体中含有如SEQ ID NO.1所示的同源臂序列。本发明在核糖体基因区较高的同源重组效率基础上，旨在针对核糖体基因区位点，利用本发明有效地将目的基因打靶到小鼠不同类型细胞的核糖体基因区，再通过启动子陷阱策略富集基因打靶阳性克隆，此外Loxp序列的引入可以实现之后不同基因在打靶位置高效替换。本发明后续主要应用小鼠胚胎干细胞的核糖体基因区打靶，再最终建立核糖体基因区打靶的小鼠模型，为验证以核糖体基因区基因打靶的有效性、生物安全性提供基础。