本发明公开了一种利用基因敲入和核移植技术在转基因非人哺乳动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法，具体地，本发明提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于乳腺特异表达蛋白基因位点并成功转染非人哺乳动物胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，或胚胎干细胞，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能使非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或单体。本发明方法所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷化合物残留。