本发明公开了一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步骤：（1）制备同源重组载体：（2）ES细胞打靶及筛选；（3）重组干细胞PCR鉴定；（4）嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊胚腔注射获得嵌合体子代；（5）F1代杂合小鼠Kv1.3^+/-繁育。此外，本发明还公开了用于构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的PCR引物对。