本发明涉及一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途。所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游均具有一个loxP序列，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。本发明的非病毒载体能游离于基因组外，并伴随着细胞周期稳定遗传，不表达病毒蛋白，并且在适当的时候能通过Tamoxifen的诱导从细胞中删除，安全性更高，有利于促进诱导多功能干细胞技术和转分化技术早日应用于临床治疗。