本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种含人类穿膜肽p53基因和GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途。具体地，本发明涉及一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列，以及GM-CSF基因或其简并序列。本发明还涉及含有所述重组溶瘤腺病毒载体的重组溶瘤腺病毒。本发明的重组溶瘤腺病毒可高效感染肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞），在肿瘤细胞内特异增殖、裂解肿瘤细胞，并高效表达人穿膜肽p53与GM-CSF蛋白，促进肿瘤细胞凋亡，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。本发明提供的重组溶瘤腺病毒可用于多种类型恶性肿瘤的治疗。