本发明公开了一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法,包括如下步骤：(1)微生物单细胞的分离；（2）总RNA的抽提；（3）总RNA的线性扩增；（4）RNA测序文库的构建；（5）RNA测序文库的分析。使用本发明的方法不仅可以实现对不同微生物细胞个体间的基因表达差异的分析，还可以实现对极端环境下不可培养的微生物进行单细胞水平的生理功能分析；此外，这一方法可以适用于真核生物单细胞的分析，肿瘤发生和演化、干细胞的诱导及发育等重要的生物学和医学研究领域等都有着非常广阔的应用。