本发明涉及干细胞分离培养技术领域，特别涉及一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂盒。该方法包括：将酶解液灌注入脐带静脉，酶解，收集脐带静脉内皮细胞；用完全培养基培养脐带静脉内皮细胞；酶解液的配方为含有II型胶原酶和透明质酸酶的基础培养基。本发明提供的脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法操作步骤简单，细胞获取率高，细胞活率高，大大缩短了原代培养周期。