本发明提供一种蚕丝支架的制备方法、应用以及三相蚕丝韧带移植物、制备方法，将蚕丝编织成具有大孔结构的网状支架，将支架划分为三个区域：韧带区、软骨区、骨区，在三区分别种骨髓间充质干细胞、携带TGF-β基因慢病毒转染的骨髓间充质干细胞及携带BMP-2基因慢病毒转染的骨髓间充质干细胞，卷折分区修饰的网状支架，形成具有生理过渡结构的仿生韧带移植物，本发明不仅避免了软硬组织直接连接造成的应力集中的问题，而且种植基因修饰的骨髓间充质干细胞具有良好的定向分化特性，节省了种植多种不同细胞的培养时间和步骤，还解决了目前单相组织工程韧带存在的韧带移植物-骨结合部生物固定不牢靠的问题以及传统方法细胞无法长入深层的问题。