本发明公开了一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）用Wbbase混合酶一次性分离人表皮干细胞、基底层角质细胞和黑色素干细胞等；（2）两步培养法：a)三种细胞无血清混合单层培养；b)细胞的诱导分化及3D结构表皮细胞膜片的培养；（3）细胞膜片的剥离。（4）治疗白癜风、烧伤等皮肤色素脱失性疾病的临床应用。本发明的创造性：（1）同时分离三种细胞，有效时间比传统的胰蛋白酶分离提高150-300倍，不需中和酶的活性，分离的细胞活性大于95%，总收率大于1-5×10⁷/克皮肤；（2）两步培养法同时扩增三种细胞，扩增倍数提升5倍；（3）黑色素形成单位与正常人接近；（4）移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。