本发明公开了一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，包括步骤：取食蟹猴睾丸组织，获取高比例的睾丸间质细胞，完全培养基培养20～28h后更换新鲜培养液，继续培养，传代至形态均一的呈现成纤维状生长的睾丸间质细胞；利用携带Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染睾丸间质细胞，然后进行荧光标记细胞筛选，传代至稳定表达Egfp的细胞株；再筛选稳定表达Egfp的细胞株，鉴定出睾丸间质祖细胞以后，继续传代50代以上，最终建立了食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。转入Large T的睾丸间质祖细胞细胞系体外传代已超过62代，表达睾丸间质细胞标志蛋白CYP11A1，CYP17A1和STAR，同时也表达Pdgfral和Lifr等间质干细胞的标记基因，细胞外形维持成纤维状，证明了获得了特征的睾丸间质祖细胞系。