本发明提供了人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备及其应用。所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。本发明将得到的人组织先切成薄片后再进行脱细胞操作，在保证脱细胞彻底性的同时极大的缩短了脱细胞时间，从而节省了大量的时间，确保今后商品化的可能。本发明中还发现了人心脏瓣膜脱细胞基质在体外细胞培养中具有促进干细胞黏附，增殖及心肌方向分化的作用，移植到心梗心脏表面可以有效改善心功能，因此可以作为新的体外细胞培养介质及移植物用于心脏病干细胞治疗。