本发明涉及一种双相多孔三维细胞培养支架由粗纤维相和细纤维相两种直径截然不同的材料构成的，其中粗纤维相比所培养的细胞的尺寸大，细纤维相比所培养细胞的尺寸小，粗纤维相分为多层粗纤维结构，所述相邻两层粗纤维结构按一定角度排列，细纤维相单独结合在粗纤维相的一面或多面；细纤维相均匀分布或集中分布在粗纤维相构成的三维细胞培养支架的孔洞结构中。本发明双相多孔三维细胞培养支架中细纤维相具有比细胞小的多的直径，细胞能够很容易贴附到纳米纤维上，还能够有效的促进干细胞在其上的分化。因此，添加细纤维到三维细胞培养支架上能够提高细胞接种效率，并能够对在其上生长的细胞，特别是干细胞的成长和分化起到促进和调控作用。