本发明提供了一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法，步骤如下：（1）提取人绒毛组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；（2）设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来；（3）PCR产物的回收和纯化；（4）基因酶切连接转化。本发明的能够有效克隆该ES61编码基因，方便了以后ES61多肽基因的定量检测，为以后研究ES61多肽基因功能奠定了基础。