本发明涉及一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法，包括：静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板；通过层层自组装技术将带正电的壳聚糖(CS)和带负电的丝素蛋白(SF)逐层交替组装到纳米纤维表面，组装5.5-10.5层，形成CS-SF复合纳米纤维膜；在该膜表面种植以绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶标记的脂肪间充质干细胞或心脏祖细胞种子细胞，通过三维共培养，制得该补片，其具有良好生物相容性，可作为细胞载体，还具有抗氧化应激的作用，可提高干细胞的存活率和治疗效率，还可评估移植干细胞的数量、分布和功能状态，能有效预防心肌梗死后心力衰竭的发生和降低缺血性心肌病的死亡率。