本发明公开了两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系及其分离方法和应用。取用刚切除的乳腺癌肿瘤标本，先经胶原酶消化处理再过滤；流式细胞仪分选出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的细胞，调节要求细胞纯度在98％以上；配置乳腺癌干细胞培养剂，将分选出的细胞经单克隆筛选后接种于含有乳腺癌干细胞培养剂的超低粘附的培养皿中，在原代培养中加入青霉素及链霉素，CO₂培养箱培养。本发明的可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系在连续传代过程中均保持着干细胞成球、自我更新、CD44⁺CD24^-/low？Lin^-ALDH1⁺表型、多潜能分化、体外软琼脂成瘤能力、裸鼠体内成瘤能力、裸鼠体内成瘤多潜能分化能力。