本发明公开了一种前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2～0.6％(w/v)的I型胶原酶溶液消化4～6h；(2)终止消化，用100～400目筛网过滤，1000～2000rpm离心4～10min，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，2～3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3～4天换液一次，在细胞融合度为80％～90％时收获细胞，即可。本发明前交叉韧带残端来源的间充质干细胞综合韧带细胞的稳定表型和MSC“干性”特征两者的优点，其分化确切，生物活性优良，是未来韧带再生及其转化医学研究中较为理想的一种种子细胞来源，临床应用前景良好。