本发明公开了一种表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途，本发明所述的方法包括：提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；饲养小鼠至1周龄或以上，分离睾丸，去除被膜和血管，暴露生精小管后用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液；通过流式细胞仪进行分选，获得单个细胞，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的睾丸间质干细胞。本发明提供了根据上述方法分离的睾丸间质来源干/祖细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗睾酮水平低下的相关疾病的组合物的用途。