本发明公开了一种体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：对检测合格的脐带组织进行清洗；剪切；接种于细胞培养皿中；不加培养液于培养箱内静置培养；加入完全培养基培养；加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理；将消化液进行离心，沉淀得到脐带间充质干细胞；接种至微孔板中，加入完全培养基，置于培养箱内静置培养；转移至搅拌生物反应器中，连续搅拌培养；消化处理得到脐带间充质干细胞单细胞悬液；重复培养，实现脐带间充质干细胞的扩大再培养。本发明因不受培养表面积限制而实现了细胞体外扩增最大化，能统一控制各聚集体的生长进度，保证营养的最大吸收度，而且还节省了附加材料的成本。