本发明提供一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法：对新鲜娩出胎盘立即进行预处理，然后分离出脐动脉和脐静脉；用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；用酶消化液灌注胎盘绒毛血管，置37℃温度下消化5～20min；用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体；将得到的液体离心，弃上清后重悬细胞；重悬的细胞悬液经羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离，得到本发明临床应用级胎盘造血干细胞。该方法不仅能够提高所制备的胎盘造血干细胞的数量、活力以及CD34阳性细胞的含量，而且是临床应用级的，无潜在病原体污染，另外，该方法制备成本低。