本发明公开了一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，用DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，增加了细胞的贴壁，明显减少了破骨样细胞的生长，有利于hUCB-MSCs集落的形成，大大提高了hUCB-MSCs培养的成功率；继续用DMEM/F12传代培养至P2代，同时采用酶消化和差速贴壁法结合，明显有利于P1-P2代细胞的纯化；P3代以后改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，保持了hUCB-MSCs的标志蛋白及良好的形态学特征和生长特性，并保持了hUCB-MSCs的多向分化潜能；另外，本发明所采用的培养基成本明显降低。