本发明涉及一种小鼠脐带间充质干细胞的分离培养方法，属于细胞体外培养领域；此方法是对“组织贴壁法”的改良和创新，本发明首先将孕龄达15-19天的孕鼠串珠样受孕子宫取出，放入含青霉素和链霉素双抗的PBS中浸泡；然后分离出脐带组织，放入含青霉素和链霉素双抗的PBS中洗涤并浸泡，其后置于培养基中剪碎、培养；当P0代细胞生长融合达80-90%时，用0.25%的胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态，本发明中所用培养基为F12/DMEM，并且添加了胎牛血清；使用本发明分离和培养方法能够获得大量高活性高纯度的小鼠脐带间充质干细胞，并且在长期传代中仍能维持干细胞的活性；本发明解决了小鼠实验动物模型构建中移植方式受限的问题，还为相关疾病细胞分子机制的研究提供依据。