本发明涉及一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用，具体提供了向软骨细胞分化的脐带间充质干细胞的制备方法，该方法得到的向软骨细胞分化的间充质干细胞，及其制备的药物在治疗骨关节炎中的应用。其中，所述方法包括在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离；诱导分化培养基为高糖DMEM加入100μg/ml丙酮酸钠，10ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，40μg/ml脯氨酸，1×ITS+1premix。采用本发明的方法构建的无支架软骨可用于受损关节软骨的修复。