本发明公开了一种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法。该方法包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其中所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。本发明充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。