本发明涉及一种人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法，主要特征在于由羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液（18AA-IV）、二甲基亚砜和人血清白蛋白组成干细胞冻存液，它们的终体积百分含量分别是48.2%、2%、4.8%、20%。该冻存液具有高复苏活率（>99%）和可直接静脉回输的特点。同时本发明还提供了上述冻存液的制备和使用方法。具体是无菌环境下，冻存液各组分按先后顺序预混好后，加入干细胞悬液并混匀，之后装入冻存袋冷冻保存。加有冻存液的干细胞可直接放入-80℃低温冰箱保存，无需使用程序降温仪，操作简便、使用安全。