本发明涉及一种成年兽皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法。剪取成年兽皮肤，去除毛发、脂肪和污垢后于75%酒精浸泡，用PBS清洗后剪成小块，0.25%Trypsin中4℃消化过夜；皮肤块经DMEM高糖培养液清洗，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化、吹打后过400目细胞筛得到细胞悬液，转入兽皮肤干细胞培养液培养；原代培养3-4天的成年兽皮肤经PBS清洗，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA润洗、消化，轻敲平皿侧壁使细胞脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，离心后弃上清将细胞重悬后传代。本发明方法操作简便，可重复性好，培养的成年兽干细胞表达β₁-integrin和Nestin等皮肤干细胞特异蛋白，并且是碱性磷酸酶阳性。