本发明公开了一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：牙周膜的分离、用质量体积浓度为0.05-0.25％的V型胶原酶和质量体积浓度为0.05-0.25％的胰酶的混合酶对牙周膜组织进行酶解、牙周膜干细胞原代培养、采用有限稀释法分离牙周膜干细胞，采用有限稀释法分离牙周膜干细胞。本发明具有以下优点：(1)降低了成本，胰酶成本低于分散酶。(2)缩短了消化时间，牙周膜为致密的结缔组织，V型胶原酶对结缔组织的亲和力优于I型胶原酶，将V型胶原酶、胰酶结合使用，酶解效果显著提高。