本发明公开了一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法，包括:获取胎牛脐带，组织块贴壁法分离细胞；当细胞爬出后，完全培养基培养；当细胞融合度达到80％～90％后，消化1～3min，终止消化、吹打，获得牛脐带间充质干细胞；所述完全培养基为添加了EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5～10ng/mL，PDGF的浓度为5～10ng/mL。本发明采用组织块贴壁法对牛脐带MSC进行了原代分离，在无血清培养基中加入了EGF及PDGF进行培养扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的牛脐带MSC。在培养体系中添加了EGF及PDGF，不仅促进了该细胞的体外扩增，并抑制了该细胞在体外培养的分化。