本发明涉及一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，可有效解决现有人胚胎干细胞的建立方法操作复杂，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干细胞系远不能满足应用的需要的问题。解决的技术方案是，收集并培养废弃胚胎，分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，按照0.55~0.65×10⁵个/cm²的密度，混合上述细胞制备成混合饲养层，采用机械法分离废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。本发明操作简单，可以有效利用临床上大量废弃的新鲜及冷冻胚胎，并利用最佳铺皿密度，节约了饲养层细胞，大大降低了建立胚胎干细胞系的成本，为将来开发利用胚胎干细胞奠定了基础。