本发明公开了一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)洗涤脂肪组织；2)在脂肪组织中加入等体积的I型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体；3)加入FBS，盖上瓶盖后封口摇匀，离心；离心后弃上清液；4)用含有FBS的DMEM重悬沉淀，沉淀与含有FBS的DMEM的体积比为1:1，吹打均匀后形成细胞悬液；将细胞悬液接种至培养基中；5)把接种后的培养基培养；6)培养后，转移细胞培养箱中继续培养。本发明的所探索的酶解条件稳定、高效，脂肪组织被彻底酶解，各成分细胞被最大化的释放出来；在不影响ADSCs的活性的前提下，单位脂肪体积所获得的ADSCs的量相对稳定。