本发明涉及一种培养人脐带间充质干细胞的方法。它包括如下步骤：取新鲜采集的人脐带，清洗，放入脐带保护液中2-8℃保存备用；取浸泡在脐带保护液中不超过48小时的人脐带，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500U/mL和3500-4500U/mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50U注射用两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用，然后分离，培养至细胞融合度达80-90%即得。本发明能避免动物血清及动物来源的试剂带来的潜在的危险性；48小时内均可用于脐带间充质干细胞的培养，可操作性强；可大大减少因霉菌、厌氧菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。