本发明涉及一种绵羊精原干细胞的分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法，包括制备各种溶液，然后从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，经过两步酶解消化制备单细胞悬液，进而用差别贴壁法分离纯化精原干细胞，使用SSCM培养液实现绵羊精原干细胞的传代长期培养，对传代长期培养的绵羊精原干细胞进行冻存和复苏的方法。本发明提供的技术方案实现了不需使用特定的绵羊精原干细胞抗体就能获得纯度较高的绵羊精原干细胞，建立了绵羊精原干细胞传代长期培养体系、成功地建立了液氮冷冻法长期保存绵羊精原干细胞的方法。使用本发明提供的方法分离纯化并且传代的绵羊精原干细胞至少已经培养达40代以上，如果加上冻存时间，最长的培养期已达4年。