本发明涉及一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法。该方法包括以下步骤：1)将胚盘从种蛋中取出；2)将取出的胚盘消化、清洗并去除卵黄；3)将消化后的胚盘细胞进行原代培养；4)从原代培养的胚盘细胞中富集纯化胚胎干细胞。本发明的方法简单易行，准确有效，可重复性高并且成本低廉，整个分离培养体系中的设备或试剂均可自制或商品化，无需制备饲养层，无需酶消化及相关处理，无需血清，即使从一枚种蛋中也可分离培养出大约2万个纯化过的胚胎干细胞，可以供体外转染进行基因改造或表观修饰，为转基因家禽的制备夯实了技术基础，为生物反应器的发展和实现巨大商业化价值安装了助推加速器，具有极大的科研价值和推广意义。