本发明涉及细胞工程领域，公开了一种间充质干细胞及其制备方法和应用。该方法将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基以及完全培养基消化，然后将消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤，并更换新的完全培养基继续培养，培养后的梭形贴壁细胞即为间充质干细胞。本发明所述制备方法采用无血清无异种蛋白的培养基制备和用成分单一的重组酶传代，所制备的间充质干细胞直径较小且无致敏原，提高了细胞的活力，增加了患者再生治疗的安全性。