本发明公开了一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，属于干细胞冻存领域。本发明的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法包括抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.3×104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代等四个步骤。本发明具有在冷冻过程中对冻存细胞低细胞毒性损伤，低保护剂渗透性损伤，同时避免形成冰晶引起机械损伤，提高冻存细胞复苏率的特点。