本发明公开了一种大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，此方法是将皮肤组织先消化过夜，再将皮肤组织的真皮和表皮分开，再将真皮组织块贴于细胞培养皿中倒置37℃培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；真皮组织块培养至爬出细胞长满小皿即进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。本发明方法采用皮肤组织块贴壁法和酶消化法相结合的新方法，既能够有效地避免皮肤组织块贴壁法造成表皮角质细胞污染又可以避免酶消化法中长时间胰酶作用对细胞生长状态的影响。本发明为进一步深入研究皮肤组织中间质干细胞在皮肤发育、生长及损伤修复中的作用提供了可能。