本发明涉及一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用，所述的培养基包含以下组分：小分子抑制剂CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基础培养基DMEM/F12。本发明使用两个小分子抑制剂CHIR99021、XAV939和成分明确的B27/N2添加物取代了传统胚胎肝细胞培养基中的血清和饲养层细胞，提供了一种没有动物源物质、成份确定的胚胎干细胞培养基，实验证实该培养基不仅可以维持人胚胎干细胞的自我更新，并且能在较长时间内维持胚胎干细胞的未分化状态和全能性，且由于其成分清晰明确，所含蛋白和其他成分皆来自人源重组蛋白或化学合成，不会造成胚胎干细胞污染，故而不会激起相应免疫反应，引发免疫排斥。