本发明提供了一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：（1）胎盘源母体间充质干细胞的分离；和（2）胎盘源母体间充质干细胞的培养。其中，步骤（1）使用了trypLE^TM酶溶液分两步处理胎盘组织；步骤（2）使用无血清培养基。本发明的方法经过短串联重复序列（STR）图谱分析为完全母体来源，经染色体核型检查，细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度鉴定，细胞生物学功能鉴定为合格。因此，本发明方法获得的胎盘源母体间充质干细胞不含异种蛋白，可以满足临床使用的需要，尤其适合母亲自己使用，也为建立优良的胎盘源母体间充质干细胞库提供了技术保障。