本发明公开了一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法，它包括如下步骤：（1）制备饲养层：取人脐带间充质干细胞，接种至培养皿上，至细胞汇合度为40%～60%时，加入5～15μg/ml的丝裂霉素C，处理2～4h，去除丝裂霉素C，即得饲养层；（2）培养：将人诱导多能干细胞接种至步骤（1）制备的饲养层上，培养，即可。本发明方法可以长期有效培养人诱导多能干细胞，无异源细胞和异源蛋白的污染，具有良好的应用前景。