本发明公开了一种人睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途。本发明将组织活检分离的梗阻性无精症病人睾丸标本用IV型胶原酶消化，过滤消化后的细胞悬液以去除组织团块，获得人睾丸细胞，用CD51抗体标记人睾丸细胞，利用流式细胞仪进行分选，收集表达CD51的细胞，从而分离出CD51阳性的人睾丸间质干细胞。本发明还提供了通过上述方法分离获得的CD51阳性的人睾丸间质干细胞，该干细胞的培养方法及其在制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的药物中的应用。